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实时PCR检测HSV-2 DNA的方法学评价及应用

文章来源:沈阳京科妇科医院发布日期:2012-06-20

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【摘要】 目的对本室利用taq man mg技术建立的hsv-2实时定量pcr法进行方法学评价及临床应用。 方法 收集60名近期有流产史妇女的*血及血清标本,分别用fq?pcr和elisa法同时检测,并进行比较;另对fq?pcr从重复性、灵敏度、线性范围、特异性几方面进行方法学评价。结果 对60份临床标本检测,elisa法的阳性率为16.7%,fq?pcr法的阳性率为31.7%,明显高于前者(p<0.05)。fq?pcr法的重复性较好[批内cv(变异系数)值为2.29%,批间cv值为4.76%]、线性范围好(4.75×101~106 copies/μl,r=0.998)、灵敏度达到47.5copies/μl、特异性较好(对hsv-1、vero细胞、巨细胞病毒、弓形虫等无特异性扩增)。结论 实时pcr测定hsv-2方法比传统的elisa法更快速灵敏,是较有发展前途的新技术。

【关键词】 实时定量pcr; 单纯疱疹病毒2型; 生殖器疱疹

evaluation and application of real?time pcr method for detecting hsv-2

deng nian?hua (department of clinical laboratory medicine,chengdu medical college,chengdu 610083,china)

【abstract】 objective to evaluate newly established real?time pcr method with taq man mg technique and apply it into clinical research methods specimens from 60 women with recent abortion history were collected and detecteol with fq?pcr and elisa methods. fq?pcr were evaluated on reproducibility,specificity,linear range and sensitivity. results the position rate of fq?pcr and elisa is 31.7% and 16.7% respectively, the former is higher than the latter(p<0.05). the assay showed good reproducibility (intra?assay coefficients 2.29% and inter?assay coefficients 4.76%), good linear range (4.75×101?4.75×106 copies/μl,r=0.998) ,good specificity(distinguishing hsv-2 from other pathogenic microorganism) and sensitivity of 47.5 copies/μ1. conclusion fq?pcr for detecting hsv-2 is more sensitive, faster than elisa and is a promising technique.

【key words】 rea1?time pcr; hsv-2; genital herpes

单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus,hsv-2)是引起生殖器疱疹(genital herpes,gh)的主要病原体,gh具有长期潜伏性、无法较好缓解、病情反作等特点。孕妇gh还可引起胎儿宫内感染或新生儿感染,导致流产、早产、先天畸形、新生儿死亡或发生严重后遗症[1]。近年来,gh的发病率不断上升,其中部分表现不典型,甚至无症状,而及时地对这类感染者诊断并采取相应的防治措施可降低感染率[2]。

感度不高、耗时较长等缺点。而实时荧光pcr(real?time pcr)是近几年发展较为迅速的新技术,具有高敏感性、高特异性和高性等优点。本实验室在前期利用taq man mgb技术,建立一种检测hsv-2的实时定量pcr,现对该方法进行临床应用及方法学评价,结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 主要仪器及试剂

elisa定量酶标仪model550 bio?rad(美国);实时定量pcr仪rg3000(澳大利亚);实时pcr法定量标准品实验室自制;hsv-2 igm elisa kit晶美生物;引物及探针沈阳基康公司设计并合成;hsv-2sav株购自疾病预防控制病毒研究所。

1.2 标本

从2004年1月至2004年6月,以广东省各大医院就诊的近期有流产史60名妇女作为研究对象,收集*血及血清两类标本,并置于-20℃保存备用。

1.3 方法

1.3.1 抗hsv-2检测 对60例受检对象的血清样本作为样本,按照试剂盒说明书操作。

1.3.2 hsv-2的fq?pcr定量检测 分别提取60例受检对象的*血样本dna,用本实验室建立的实时pcr对hsv-2检测。引物及探针根据gg基因片段由沈阳基康公司设计并合成,分别是:fp:5′?cccctgttctggttcctaacg?3′,rp:5′?gtggatggtggtgctgatgata?3′,fam:5′?cctgctctagatatcct? 3′。实时定量pcr反应体系总体积30 μl,分别是模板dna:2.0 μl;上游引物(5 μm):3.6 μl;下游引物 (5 μm):3.6 μl;荧光探针(10 mm):0.9 ml;dntp mixture(10 mm):2.4 ml;taq dna聚合酶:0.2 ml;10×pcr buffer:3.0 ml;mgcl2(25 mm):6.0 ml;ddh2o:8.3 ml。反应条件:95℃ 5 min;94℃ 15 s,60℃ 60 s,30个循环。

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